SPAD陣列在共聚焦顯微鏡中的超分辨率成像應用——基于波動對比度的SOFISM方法

隨著成像技術的不斷進步，許多微觀世界的奧妙被人類不斷的發現和記錄下來，成為科技進步的重要研究工具。但是傳統遠場光學顯微鏡受到“阿貝衍射極限"的限制，在空間分辨率上存在天然瓶頸，導致很多領域的研究受到了阻礙。近年來，雖然有如STED、PALM、STORM等超分辨率顯微技術不斷成熟，但這些方法對設備配置和操作要求較高，實驗復雜性大，價格昂貴，難以滿足當今快速發展的科學研究。

相比之下，一種被稱為圖像掃描顯微技術（Image Scanning Microscopy, ISM）的方法正在受到關注。該方法僅需替換探測器并更改成像分析方案，便可實現分辨率與圖像對比度的提升，具備較強的實用性。

為進一步突破成像分辨率，同時保持系統的簡潔性，研究人員將單光子雪崩二極管陣列（SPAD array）與ISM方法結合，提出了一種新型超分辨率成像方案——SOFISM（Super-resolution Optical Fluctuation Image Scanning Microscopy）。本文也是針對此方法，做了一些原理方面的論述，同時講述了一些研究成果和應用方向，歡迎大家來電討論溝通。

技術原理與系統構成

1.   SOFISM的工作原理

該技術在傳統共聚焦顯微鏡的基礎上，進行如下改造：

1. - 用23像素的陣列SPAD替代共聚焦中的點探測器

2. - 每當激光掃描樣本時，SPAD陣列會記錄下每個像素檢測到的光子到達時間

3. - 系統將陣列中任意兩個像素組合，計算其二階或更高階相關函數

4. - 相關函數用于重建圖像，可有效增強對比度并提升分辨率

SOFISM的圖像增強效果，主要來自兩個方面：

1. - 單個SPAD像素的點擴散函數（PSF）變窄（提升√2倍分辨率）

2. - 不同像素之間的相關計算進一步提升分辨率（zui終可達4倍）

2.  SPAD陣列的優勢

SPAD陣列是一種基于cmos工藝制造的光子探測器，具備以下突出特點：

1. - 可實現單光子探測且內置了tdc

2. - 具備20ps的時間分辨率

3. - 能實時的快速數據采集和傳輸

4. - 陣列化布局可拓展為高分辨率圖像傳感實驗驗證與成像效果

研究團隊采用了CdSe/CdS/ZnS核殼結構的量子點樣本進行實測。

分別獲得了以下圖像結果：

1. - CLSM圖像：普通共聚焦圖像，存在明顯的模糊與噪聲

2. - ISM圖像：清晰度提升至原來的2倍，噪聲降低

3. - SOFISM（二階相關）：分辨率提升至約2.5倍

4. - SOFISM（四階相關）：分辨率理論上可達原始圖像的4倍

在整個過程中，每個像素僅需幾毫秒的駐留時間，即可完成高信噪比圖像采集，非常適合動態樣本或弱熒光場景的測量需求。

系統核心配置

系統關鍵核心硬件如下：

1. - 激發光源：標準共聚焦激光掃描器

2. - 探測器：單光子陣列探測器

本次實驗所使用的單光子陣列探測器—SPAD23，它之所以非常適合應用于SOFISM超分辨率顯微成像系統，主要是因為它的多個核心特性正好匹配該成像方案的技術需求與成像邏輯。其優勢如下：

單光子靈敏度

SOFISM依賴熒光信號中的微弱強度波動，這些波動往往涉及單光子級別的統計變化。SPAD23具備真正的單光子探測能力，可以高效捕獲微弱的熒光閃爍事件，為后續的相關性計算提供了高SNR的輸入數據。

PS級時間分辨率（20ps）

SOFISM的核心是對熒光發射過程中的時間相關性進行計算。SPAD23每個像素都集成了一個20 ps分辨率的TDC（時間數字轉換器），可實時記錄光子到達時間，為高階相關函數（如二階、四階）提供數據，基礎SOFISM中越高階的相關函數越需要時間分辨率高，SPAD23的10ps Bin寬和20ps的時間戳精度可以提供有力的支撐。

陣列結構支持多像素關聯計算

SOFISM通過多個像素之間的協同工作進行圖像重建。SPAD23采用六邊形排列的23像素陣列結構，不僅提升了視場范圍，還允許計算23個像素對的時間相關性，這對于圖像分辨率增強至關重要。SOFISM計算跨像素相關性，SPAD23提供了充足的像素數量和布局密度，確保成像精度和算法穩定性。

高填充因子和光子收集能力

SOFISM需要快速、高信噪比成像，SPAD23的像素填充因子超過80%，單像素尺寸為23μm，光敏面達1.3mm×1.3mm，有效提升了光子收集效率。這對于弱熒光樣本尤為重要，可減少曝光時間與激發強度。SPAD23的高光敏設計極大優化成像效率。

互不干擾的獨立工作機制

SOFISM成像中每個像素都承擔獨立信號通道的角色。SPAD23的每個SPAD + TDC模塊彼此互不影響死時間，可以實現并行、高效的數據采集，避免了光子堆積導致的信息丟失。

緊湊集成的體積設計

傳統的SPAD + 多通道TDC系統通常龐大而復雜，而SPAD 23將所有探測器與時間采集電路集成在一塊微型模塊上，體積僅為半部手機大小，非常適合放置于現有共聚焦系統的成像面上。

應用優勢

高分辨率、高對比度

1. - 在不引入額外復雜光學路徑的前提下，實現2-4倍分辨率提升，SPAD 93的問世，可以更進一步的提高分辨率

2. - 有效抑制熒光閃爍帶來的圖像噪聲

簡單易用、集成度高

1. - 不需調整光路或添加特殊探測模塊

2. - 結合SPAD的高速響應，可兼容高速活體成像

適配性強、兼容主流共聚焦平臺

1. - 可作為傳統共聚焦系統的升級模塊

2. - 特別適用于高時間分辨、低光照、活細胞熒光研究

SOFISM方法結合SPAD陣列的時間靈敏性與圖像掃描顯微的結構優勢，為生物顯微成像提供了一種“低成本 + 高性能"的超分辨解決方案

如您對設備的實際表現感興趣，可聯系我司的相關負責人，申請設備現場Demo。

關于昊量光電：

上海昊量光電設備有限公司是光電產品專業代理商，產品包括各類激光器、光電調制器、光學測量設備、光學元件等，涉及應用涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫療、科學研究、國防、量子光學、生物顯微、物聯傳感、激光制造等；可為客戶提供完整的設備安裝，培訓，硬件開發，軟件開發，系統集成等服務。